[Cahier Technique] Vers la bio-impression de tissus humains fonctionnels

Ces dernières années, l’ingénierie tissulaire a bénéficié des avancées rapides dans le domaine de la fabrication additive. En effet, des procédés fondés sur des techniques de « bio-­impression » sont apparus et se généralisent peu à peu dans les laboratoires. Ils permettent de créer des tissus vivants en additionnant des couches de biomatériaux entrant dans la composition physiologique du tissu que l’on souhaite reproduire. Ces biomatériaux sont mis en œuvre sous la forme d’une « bio-encre » qui apporte aux cellules une structure assurant à la fois leur maintien et leur positionnement spécifique dans l’espace. Associée à des conditions de culture spécifiques, cette bio-encre constitue un atout majeur pour guider le développement des cellules et ainsi générer des tissus de plus en plus complexes et différenciés. Cette complexité nouvelle des tissus est précieuse car elle permet de les fonctionnaliser de plus en plus.

Chaque tissu humain, même le plus anodin, remplit une fonction dans le corps. Elle découle à la fois de la composition ­physiologique du tissu, mais aussi de sa ­structure. Par exemple, les tissus des os ou des dents peuvent offrir de grandes propriétés mécaniques pour assurer leur fonction, et ceux de la peau et des autres épithéliums possèdent des structures permettant une protection contre les agents pathogènes extérieurs ou contre la perte d’eau massive. Le positionnement en 3D de la structure de certaines cellules permet de doter le tissu d’activités spécifiques (comme la sécrétion). Au fur et à mesure des développements techniques de la bio-impression et de l’avancée des connaissances, ce champ de l’impression 3D est devenu un domaine transdisciplinaire, combinant l’ingénierie tissulaire, la science des matériaux, la biologie cellulaire et la biochimie. L’objectif est aujourd’hui de développer des tissus pleinement fonctionnels pouvant entrer dans la fabrication d’organes imprimés en 3D.

1. Des technologies opérationnelles

Il existe aujourd’hui trois grandes techniques de bio-impression : le jet d’encre, l’extrusion et le dépôt par expulsion laser (fig. 1). Chacune de ces techniques présente des avantages et des inconvénients, liés en particulier à la résolution obtenue, à la capacité à produire des tissus de grande taille et à la cytotoxicité du procédé. Le dépôt par laser est la technique offrant la plus haute résolution (0 à 50 µm, avec un dépôt de cellule unique) sans toutefois permettre d’atteindre des objets de taille physiologique (de plusieurs centimètres). De son côté, la technique de l’impression par jet d’encre possède une résolution intermédiaire (50 à 100 µm). Elle permet d’obtenir des objets centimétriques, soit la taille des tissus. Enfin, l’extrusion affiche la résolution la plus basse (autour de 100 µm) mais permet, grâce à la rhéologie des bio-encres utilisées, d’imprimer des objets vivants de taille décimétrique.

Fig 1

Ces technologies ont beaucoup évolué ces dernières années et des fabricants fournissent maintenant des bio-imprimantes intéressantes. Elles ont été le socle des nombreuses preuves de concept produites dans le domaine de l’ingénierie tissulaire. On notera, par exemple, plusieurs impressions de peaux complexes, de vaisseaux sanguins, de cartilages ou encore d’une rétine. Certains des tissus bio-imprimés ont également été implantés in vivo afin d’en démontrer la fonction biologique, mais il ne s’agit toujours que de tissus et non d’organes complets.

Le frein à la bio-impression d’organes fonctionnels complets pouvant être réimplantés reste la vascularisation des tissus bio-imprimés. En effet, elle permettrait de lever deux verrous majeurs. D’une part, le maintien en vie des objets imprimés tout au long de la maturation de l’organe (qui peut prendre plusieurs semaines) grâce à la perfusion de milieu nutritif au sein de l’objet. D’autre part, la création d’un réseau vasculaire doté d’une certaine résistance pourrait rendre possible des opérations de microchirurgie permettant le raccordement de veines ou d’artères (anastomose) lors de l’implantation.

2. Le défi de la conservation des cellules

Afin de fabriquer des tissus vivants et potentiellement implantables chez l’être humain, il est nécessaire d’y inclure des cellules vivantes, mais surtout de les garder vivantes. Elles sont bien sûr importantes, car ce sont elles qui amènent la fonctionnalité et la spécificité aux tissus, soit grâce à leurs fonctions propres, soit par leur positionnement. Cependant, les techniques de bio-impression sont des procédés pouvant être traumatisants pour les cellules et les conduire à des endommagements de différentes natures : lyse, nécrose, apoptose, sénescence, dérive phénotypique, délétion, mutation ou encore perte de fonction physiologique. Ainsi, il est vital de trouver un équilibre entre le traumatisme appliqué aux cellules et les performances du procédé de bio-impression.

Ce point d’équilibre est déterminé d’une part par les paramètres de bio-impression, comme le débit de matière, les équipements (forme et diamètre de buse), la vitesse ou encore la résolution d’impression, et d’autre part par les propriétés rhéologiques de la bio-encre. Ces deux facteurs génèrent des contraintes – comme la pression autour de la surface membranaire – sur les cellules, à l’origine de leur possible endommagement. Mais il est à noter que plus la contrainte est forte, plus les cellules risquent d’être endommagées ou traumatisées (fig. 2).

Fig. 2

La contrainte peut avoir des conséquences immédiates, comme la lyse des membranes entourant les cellules et donc leur mort, mais aussi des conséquences dites programmées. Ceci est notamment le cas pour l’apoptose, la mort programmée et différée, mais aussi le changement phénotypique. Ce dernier effet est plus insidieux puisqu’il entraîne un changement de fonctionnalité des cellules bio-imprimées qui vont par exemple passer d’un phénotype « fibroblaste de peau » à un phénotype « fibroblaste cicatriciel », dont les comportements seront très différents. L’effet sur le tissu obtenu sera alors important et les fonctionnalités désirées ne pourront être obtenues. Afin de diminuer, voire annuler, le risque d’endommagement des cellules lors de leur utilisation en bio-impression, il est important de comprendre la formation des champs de contraintes autour des cellules. Cette compréhension passe avant tout par une analyse approfondie du comportement rhéologique des bio-encres.

Dotées majoritairement d’un comportement de seuil à l’écoulement permettant le maintien de l’objet en cours d’impression, les bio-encres sont des hydrogels présentant des résistances au cisaillement (viscosité) plus ou moins importantes. Vulgairement, les bio-encres sont des pâtes plus ou moins épaisses et c’est là tout l’enjeu de l’endommagement des cellules. Pour comprendre le lien entre viscosité, contrainte et risque d’endommagement des cellules au sein des techniques de bio-impression, il suffit de faire l’analogie avec des personnes entrant dans un couloir. Ce dernier représente les buses de dépôt ou d’éjection, les personnes figurent les cellules et l’environnement correspond à la bio-encre. Si nous prenons l’exemple d’un couloir court, large, constitué d’air et qu’un très faible nombre de personnes le traverse, alors la traversée ne sera pas « contraignante ». Si le couloir est long, étroit, rempli d’une matière épaisse (imaginons une crème) et qu’une foule de personnes le traverse, alors l’aventure sera plus contraignante. Ces personnes vont s’entrechoquer entre elles, contre les parois du couloir et les frottements ressentis à l’interface de la matière épaisse seront irritants. Nous pouvons ajouter que certaines personnes (cellules) seront plus résistantes à la traversée que d’autres, mais leur devenir est scellé dans ce scénario.

Dans le cas de la bio-impression, il faut donc faire attention à la compétition entre deux critères importants : le maintien de l’objet et la survie des cellules. En effet, l’utilisation de bio-encres moins visqueuses pour garantir la survie cellulaire ne doit pas se faire au détriment du maintien de l’objet qui a besoin d’une viscosité plus importante pour ne pas s’effondrer. Un comportement rhéologique dit de rhéofluidification apporte une solution efficace. Il s’agit d’une propriété des matériaux dans laquelle la viscosité diminue lorsque la vitesse de cisaillement augmente. Cela signifie que lorsque les cellules sont mises en mouvement durant le procédé de bio-impression, la bio-encre se liquéfie, diminuant ainsi la contrainte exercée sur les cellules. L’alliance d’un comportement rhéofluidifiant et de l’optimisation des paramètres d’impression va alors permettre de préserver la santé des cellules. Il est donc essentiel d’entourer l’activité de bio-­impression d’un ensemble de contrôles et de caractérisations de la bio-encre et des cellules afin d’assurer la maîtrise de leur devenir.

3. Des architectures 3D pour fonctionnaliser les tissus

Au cours de la bio-impression, les cellules et les biomatériaux vont être mis en forme en trois dimensions. Cela va avoir une influence directe sur le devenir du tissu. Certaines fonctions sont en effet liées à la structure ou à l’architecture du tissu. Cela est notamment le cas pour les tissus multi-couches, comme la peau et de manière générale les épithéliums, mais également pour les systèmes tubulaires, tels que les vaisseaux sanguins, la trachée, l’œsophage ou l’urètre.

Obtenir ces architectures complexes demande aux technologies de bio-impression d’utiliser des bio-encres auto­portantes (comportement rhéologique de seuil à l’écoulement), afin de ne pas s’effondrer au cours de l’étape d’impression, mais également des bio-encres pouvant être consolidées après la bio-impression, afin de maintenir la forme obtenue suffisamment longtemps pour permettre au tissu de se développer (fig. 3). L’aspect autoportant peut être en partie contourné grâce à l’utilisation de technologies de bio-impression en milieu contraint, dans lesquelles la gravité est contrebalancée par la présence d’un gel suspendant. Toutefois, les techniques les plus avancées restent celles dans lesquelles le caractère autoportant de la bio-encre est régi par ses propriétés rhéologiques et notamment son seuil d’écoulement. En effet, ce seuil est considéré comme étant la résistance à l’effondrement d’une bio-encre et c’est lui qui permettra à l’objet bio-imprimé de conserver sa forme au cours de l’impression.

Fig. 3

La consolidation du futur tissu est ensuite un enjeu majeur puisque c’est elle qui permettra à la forme de ne pas se dégrader au cours des étapes suivantes de développement. Cette stabilité sera la garantie d’obtenir un tissu ou un organe ayant la géométrie désirée et choisie au moment de la bio-impression, et non une géométrie dégradée. Cette consolidation utilise de façon très majoritaire des techniques de réticulation douces, c’est-à-dire compatibles avec la présence de cellules. Sont ainsi exclus les agents chimiques agressifs tels que les agents réticulants.

Sont également exclues, du moins pour des applications implantables de la bio-impression, les techniques de réticulation par voie photochimique, très utilisées en impression 3D (stéréolithographie) mais trop nocives pour être validées. Restent alors les réticulations ioniques et enzymatiques, qui pourront générer des architectures supramoléculaires stables, à partir des biomolécules présentes dans la bio-encre (collagène, alginate, cellulose, matrice extracellulaire…). Le procédé Fresh émerge également. Il consiste à imprimer les cellules dans un gel porteur autocicatrisant (fig. 4). Produire des structures dans lesquelles les cellules survivent et se développent et ayant une architecture prédéfinie est une obligation dans le développement de tissus humains fonctionnels. Cela n’est cependant pas suffisant. La structure combinée aux cellules et à une composition de biomatériaux ne permet pas encore d’obtenir des fonctions complexes ou des propriétés fonctionnelles telles qu’attendues lors de la réimplantation (suture, résistance mécanique aux chocs ou aux flux…).

Fig.4

4. Accompagner et diriger le développement des cellules

Les tissus bio-imprimés, comme tous les assemblages multi-cellulaires in vitro, nécessitent une période de maturation afin de devenir ce que les chercheurs souhaitent obtenir, c’est-à-dire des structures fonctionnelles. Pour ce faire, une armada technologique est mise en œuvre afin de contrôler les conditions de culture au sein de bioréacteurs. L’objectif est ici de surveiller et de diriger la nutrition des cellules en développement, mais également de stimuler physiquement les tissus en voie de développement. Ceux devant présenter une résistance mécanique, comme les cartilages, devront ainsi être cultivés sous contrainte de compression, comme c’est le cas dans le corps humain. Ceux dans lesquels des fluides se déplacent (endothéliums de type veine, artère, urètre) devront être maturés en présence d’un flux, pulsatile ou non. Ceux devant présenter une certaine élasticité, comme la peau, seront cultivés sous contrainte d’élongation afin d’induire l’organisation des fibres élastiques présentes dans le tissu mature.

Afin de permettre cet ensemble de maturations dynamiques tout en conservant la stérilité des tissus bio-­imprimés et en contrôlant les paramètres biologiques liés à la culture de cellules de mammifères (37 °C, pH7, 40 % d’oxygène, élimination des déchets), des méthodes dites de bioprocédés sont en train d’émerger (fig. 5). Héritées du génie des procédés et des techniques de bioproduction industrielles en bioréacteurs, elles sont actuellement en développement afin d’accueillir des tissus et des organes bio-imprimés de toutes sortes. Leurs avantages sont liés à une foule de capteurs et d’actuateurs permettant de contrôler mais également d’influencer la maturation des différents tissus en fonction de leur devenir biologique. Par exemple, le cartilage nécessite un environnement plutôt anoxique (faible taux d’oxygène), car les cellules qui le composent y sont habituées dans le corps humain. La peau devra être cultivée à l’interface air-liquide puisqu’il s’agit d’un épithélium. Dans un nombre grandissant de cas, ces bioréacteurs pour tissus bio-imprimés sont eux aussi produits sur mesure par impression 3D de matériaux plastiques biocompatibles.

Fig. 5

5. Des applications prometteuses

Une application envisagée, qui offre de grands espoirs à la médecine, se trouve dans les domaines de la régénération et la reconstruction. Elle se heurte cependant encore à de nombreux freins. En effet, les tissus humains fonctionnels fabriqués au laboratoire pour une utilisation chez l’être humain – les greffons – doivent présenter certaines caractéristiques obligatoires. La présence de vascularisation est l’une d’entre elles. La réimplantation d’un tissu au sein d’un corps vivant requiert dans la grande majorité des cas une étape de microchirurgie de type anastomose au cours de laquelle la circulation sanguine du receveur doit être connectée à celle du greffon. Cette vascularisation du tissu produit au laboratoire est le verrou actuel de la fabrication de tissus humains fonctionnels. La taille et la complexité de la structure des vaisseaux sanguins en font des architectures pour l’instant impossibles à maîtriser au cours de l’étape de ­bio-impression. Seules quelques ­stratégies d’auto-­assemblage permettent de s’approcher des structures requises sans toutefois obtenir les propriétés mécaniques nécessaires à l’anastomose. En effet, cette connexion à la circulation sanguine se fait par suture et nécessite une résistance mécanique très élevée des tissus. Cette dernière est également un prérequis pour toutes les autres implantations, même la plus simple comme celle de la peau au cours de laquelle les zones de contact latérales entre la peau du patient et la peau réimplantée sont souvent maintenues par des agrafes ou des points de suture.

Une autre application intéressante est la fabrication de modèles thérapeutiques et pathologiques. Il s’agit de l’usage pour le moment le plus abouti de la bio-impression car il s’affranchit des contraintes de la réimplantation. Les tissus humains fonctionnels peuvent également être destinés à des études in vitro de leur fonctionnalité en présence de conditions mimant des situations thérapeutiques. Cela sera le cas pour des modèles de tissus sains qui seront soumis à une batterie de tests en présence d’agents chimiques ou pharmacologiques. Les tissus devront donc au minimum présenter la fonction étudiée et au mieux un ensemble le plus complexe possible de fonctions, recréant un contexte physiologique au plus proche d’un corps humain complet. Ceci n’est bien sûr pas possible et afin de pallier la difficulté de cette approche, de multiples tissus fonctionnels sont assemblés au sein de dispositifs d’étude appelés « organ-on-chip » ou « tissue-on-chip », dans lesquels les différents tissus sont reliés par un circuit fluidique.

Les études in vitro seront également menées pour des tissus fonctionnels recréant des situations pathologiques comme le cancer. Les cellules utilisées seront alors bien différentes de celles nécessaires aux tissus implantables puisque ce seront des cellules extraites de tissus malades. Le but de leur fabrication sera de recréer ce que l’on appelle l’environnement pathologique, c’est-à-dire l’ensemble des propriétés du tissu malade. Ces dernières sont la présence déséquilibrée de certaines cellules et de certaines molécules composant le tissu, mais également de certaines structures, comme l’hypervascularisation des tumeurs.

6. Des perspectives cliniques encore lointaines

Il reste des freins techniques à l’implantation de tissus humains fonctionnels fabriqués en laboratoire. Il existe également des freins réglementaires et éthiques au développement de ces tissus. Réglementaires, car ces tissus sont considérés comme des médicaments (médicament de thérapie innovante ou thérapie cellulaire). Leur développement et leur validation seront étroitement encadrés par une série de règles et de normes. Celles-ci porteront en premier lieu sur les composants de la bio-encre qui doivent être de grade pharmaceutique, biocompatibles et dans le meilleur des cas déjà validés séparément pour des applications chez l’être humain. Les règles concerneront ensuite les cellules qui doivent être extraites du patient (situation autologue) ou sélectionnées selon leur classification dans le système de reconnaissance du soi (situation allogénique) et cultivées dans des conditions de culture dites « good manufacturing practice » (GMP). Les normes réglementeront enfin les appareillages de bio-­impression qui devront être qualifiés afin de garantir la fidélité de la structure imprimée mais également le ­stockage et la traçabilité de la fabrication. Viendront ensuite les études précliniques sur animaux, les études cliniques de phase 1, puis celles de phase 2. La route est donc longue, très longue, pour qui souhaiterait développer une activité médicale impliquant la bio-impression de tissus humains fonctionnels implantables. cc